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细胞培养（Cell Culture）是指在人工模拟体内的生长环境（无菌、适宜温度及酸碱度）下，为细胞保证充足的营养供应，使其不断生长繁殖并维持正常的结构和功能。细胞培养是生物、医学基础研究中非常重要的基础实验技术之一，而很多初学者常常在细胞培养过程中都会遇到一定的困难和挑战，针对这些情况，本篇将为大家带来关于细胞培养的保姆级指南！
细胞类型
根据细胞的来源
1）原代细胞(Primary Cell)：直接从体内获取的细胞、器官或者组织中分离出的第一代细胞。原代细胞更接近于细胞的在体状态及特性，不过它的获取及建系都比较困难。
2）细胞系(Cell Line)：是由原代细胞经传代成功后即为细胞系。细胞系泛指一般可能传代的细胞，能够连续传代的细胞叫做连续细胞系或无限细胞系，不能连续培养的则称为有限细胞系。
3）细胞株(Cell Strain)：通过选择法或克隆形成法从原代培养细胞中获得具有特殊性质或标志物（整个培养期间始终存在）的细胞称为细胞株。一般认为，细胞株是用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群。
根据生长方式
1）贴壁细胞(Adherent Cell)：这类细胞的生长必须有可以贴附的支持物表面，细胞依靠自身分泌的或培养基中提供的贴附因子才能在该表面上生长，繁殖。
2）悬浮细胞(Suspension Cell)：这类细胞的生长不依赖支持物表面，在培养液中呈悬浮状态生长。
3）半贴壁细胞(Semi-Adherent Cell)：部分细胞贴附在培养器皿表面生长，部分细胞悬浮在培养液中生长。
营养需求
1）培养体系：分为含血清培养体系和无血清培养体系。简单、小规模的培养可选择含血清的培养体系；长周期、强掌控、追求细胞质量的培养则选择无血清的培养体系。
2）血清：分为胎牛血清、新生牛血清以及小牛血清，常用浓度为5-20%，其中10%是最为常见的。胎牛血清的普适性是最强的。血清中的微量元素可参与细胞的解毒代谢，而里面的抗蛋白酶成分则具有中和保护细胞的作用。血清需要在56 ℃、30分钟的条件下进行灭活，以去除里面的补体成分，从而避免补体对细胞产生毒性作用，不过灭活也会导致一些对细胞有利成分的损耗。
3) 基础培养基的选择：分为天然培养基（组织提取液）、合成培养基（如1640、DMEM等）、无血清培养基（如X-VIXO系列培养基）。基础培养基中必需成分为氨基酸、维生素、无机盐、缓冲体系。目前使用居多的是合成培养基以及无血清培养基。
了解细胞的详细信息及培养需求
1) 细胞特性：细胞的形态、增殖速度、细胞周期、传代频率……
2) 生长方式：贴壁细胞还是悬浮细胞？
3) 培养体系：含血清培养基还是无血清培养基？
4) 温度：多数人和哺乳动物细胞系是36~37℃，昆虫细胞则是27℃。
5) PH：多数哺乳动物细胞系是7.4，昆虫细胞是6.2。
6) CO2：多数细胞适合5-7%CO2
7）渗透压：渗透压大小主要由培养基中各种盐成分的浓度决定。大多数细胞对渗透压都有一定耐受性。人细胞的理想渗透压为290mOsm/kg，鼠细胞的理想渗透压在320mOsm/kg左右。对于大多数哺乳动物细胞，渗透压控制在260-320mOsm/kg为宜。
8) 抗生素：在细胞培养过程中一般会添加双抗（青霉素和链霉素）或者三抗（青霉素、链霉素以及两性霉素B）来预防细胞污染。不过，如果长期的细胞培养最好不要持续使用抗生素，这样会使细胞产生耐药性。
9) 培养基中酚红的选择：酚红在细胞培养中主要作为pH值的指示剂，通过颜色变化反映培养基的酸碱度，从而间接指示细胞的生长情况。此外，酚红还能用于检测细菌污染和细胞存活率。不过，酚红是雌激素类似物，在进行激素诱导或培养雌激素敏感的细胞时应当慎用。
10) 无毒无菌无污染：无毒、无菌、无污染是在体外进行细胞培养的首要条件。在体外培养中，由于没有机体免疫系统的保护，细胞丧失了对各类微生物的防御能力以及对有害物质的解毒能力。因此在细胞培养过程中，一定要避免有毒化学物质的侵入、微生物的污染以及不同细胞间的交叉污染。
细胞培养的基本原则
无菌原则
>超净工作台环境无菌：操作前紫外灯消毒至少30分钟，并75%酒精擦拭。
>实验耗材无菌：操作用到的所有实验耗材都必须进行紫外灯照射消毒并75%酒精擦拭。
>实验前手部应进行无菌处理。
>实验过程进行无菌操作。
减少细胞环境扰动原则
>培养箱内温度恒定、CO2浓度恒定，操作前对培养基进行预热。
>转移细胞时应轻拿轻放、避免震动。
>减少细胞在培养箱外的时间。
>枪头吹打时要轻柔，避免细胞遭到破坏。
试剂分装原则
培养基、血清、胰酶等重要试剂要养成分装保存的习惯，不同的细胞即使适配的培养基配方相同也应另外配制分装并做好标记。
及时保种原则
细胞状态良好的时候，尤其是比较重要的细胞，要及时进行冻存保种以备不时之需。
细胞培养的三大基本操作
细胞复苏
1) 37℃水浴加热需要使用的培养基。
2) 从液氮中取出要复苏的细胞，尽量减少其暴露在室温（15-25℃）的时间。
3) 在37℃水浴快速解冻细胞，将冻存管转移到生物安全柜中，用70%乙醇或异丙醇擦拭冻存管外部。
4) 将细胞悬浮液转移到50mL离心管中，加入1mL培养基润洗冻存管，培养基同样收集到50mL离心管中。
5) 向50mL离心管中补加15-20mL培养基，室温300xg离心10分钟。
6) 小心弃掉离心后的上清液，使用适量完全培养基重悬细胞，分装到合适的培养皿/瓶中，显微镜下观察细胞密度和状态，放入CO2培养箱中培养。
细胞传代
1) 在显微镜下观察细胞的状态、汇合度以及是否污染，判断是否进行传代处理。
2) 以T25培养瓶、贴壁细胞为例，弃掉培养基，使用无菌PBS洗涤细胞以去除抑制胰蛋白酶功能的血清。
3) 加入2ml胰酶，覆盖细胞层，放入37℃ CO2培培养箱中孵育2min，期间可拿出观察细胞消化脱落情况（注意：不同细胞使用的胰酶浓度及消化时间不同）。
4) 弃掉胰酶，加入2ml完全培养基吹散细胞。
5) 显微镜下计数，调整细胞密度分装到培养瓶中，将细胞置于 37ºC, 5% CO2 的培养箱中培养。
细胞冻存
1) 在细胞密度达到107时，可进行冻存，采用分步冷冻法。
2) 悬浮细胞500 g室温离心10 min收集细胞沉淀，贴壁细胞胰酶消化并终止后离心收集。
3) 弃上清，冻存液重悬细胞沉淀，1 mL分装并做好标记。
4) 将冻存管放置-20℃ 1 h；-80℃过夜；转移至液氮中进行长期保存。
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